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抗冻蛋白及其在果蔬保鲜中的应用前景

时间:2014-10-01 17:01:04  来源:  作者:

抗冻蛋白(AntifeezeProteins,AFPs)是一类抑制冰晶生长的蛋白质,能以非依数性形式降低水溶液的冰点,但对熔点影响甚微,从而导致水溶液的熔点和冰点之间出现差异。这一现象被称为热迟滞现象。因而抗冻蛋白亦称为热滞蛋白或温度迟滞蛋白(Thermal Hysteresis Proteins,THPs)。抗冻蛋白的抗冻活性(Antifreeze Activity)亦称热滞活性(Thermal Hysteresis Activity,THA)被定义为其水溶液冰点与熔点之差值,差值愈大,活性愈强。AFPs于1969年由A.L. Devries在南极Mcmurdo海峡的一种鱼(Nototheneniid)的血液中首次发现,它能阻止体液内冰核的形成与生长,维持体液的非冰冻状态。这一发现引起了许多实验室的研究兴趣,研究对象从极区鱼扩展到昆虫,最后又扩展到彩天堂平台怎么样直营网,甚至微生物。科学家发现,原来AFPs在生物界广泛存在,是生物适应低温、抵御冻害的一种机制。人们试图分离纯化活性高的抗冻蛋白,并对它的基因及转基因研究,以期望将它用于改良某些生物的抗冻性能。这些研究对抗冻蛋白及其基因的结构、功能和作用机理有了较为深入的了解,并为抗冻蛋白的应用打下了良好的基础。随着人们生活水平的提高,果蔬鲜食比例呈增长趋势,果蔬保鲜是近年来的一个研究热点。

1 抗冻蛋白的特性

1.1 热滞效应(Thermal Hysteresis Action) AFPs具有特殊的热迟滞性质,即其溶液的冰点低于熔点,是AFPs最基本的特性。AFPs降低鱼血清,昆虫、植物体液或水溶液冰点的效率比一般溶质要高,按重量浓度算比NaCI的效率高2倍;按摩尔浓度算,比NaCl的效率高200-500倍。说明AFPs降低体液冰点的机制与盐类(如NaCl)不同。一般溶液(如NaCl,蔗糖溶液等)的冰点是固、液两相蒸汽压平衡时的温度,因而冰点等于熔点。而AFPs在其溶液中只影响结冰过程,几乎不影响熔化过程,所以使冰点低于熔点。例如2%抗冻糖蛋白溶液-0.9℃结冰,而结的冰直至温度上升至-0.02℃也不熔化。热滞是一种非理想溶液的行为,溶液的冰点下降是非依数性的,而其熔点的差值称为热滞值。在热滞中所谓的冰点并不是真正的冰-水平衡相变点,而是冰晶生长点。热滞值实际上是熔点与冰晶生长点之差值。AFPs的抗冻机理主要是由于冰晶与溶液的界面自由能的增加导致当温度从相变点进行降低-定值时,整个系统的自由能并不减少,从而防止冰晶生长,导致热滞现象。Raymond等(1972)首先提出热滞定量理论,并给出热滞公式,指出热滞值的大小与AFPs溶液浓度和AFPs的分子质量呈正相关,但不是线性相关。李前忠等(1994)提出抗冻蛋白热滞值的经验计算公式,所得结果与实验数据较好吻合。

1.2 冰晶形态效应 AFPs有抑制冰晶生长的作用,而且这种作用在不同的方向上有强弱之分,因而引起冰晶形态的改变。在纯水中,冰通常以平行于晶格基面(a轴)的方式生长,而在垂直于基面的方向(c轴)很少生长,故冰晶格看起来呈扁圆状。在含有抗冻蛋白溶液中,随着抗冻蛋白的浓度(μmol/1)的增加,冰晶的形态由原来的椭圆形变为六棱锥状至针状。低浓度AFP优先抑制冰晶沿a轴的实质,因此冰晶格的六边柱表面变得明显。高浓度AFP条件下,冰晶主要沿c轴生长而形成六边双棱锥及针形晶体。有关抗冻蛋白与冰晶作用机理先后有人提出结合水学说、表面结合学说、吸附一抑制学说等。就目前研究来看,吸附一抑制学说比较合理,但是解释AFPs吸附冰晶抑制其生长的理论依据尚不完善。吸附-抑制学说首先由Ramond和Devries于1977年提出,这一机理假设抗冻蛋白分子的氢键键合于冰晶晶格上,通过Kelvin效应抑制其生长。这一模型被后来的一些实验所证实和补充。1988年Yang等人首次分析了Winter flounder中类型工抗冻蛋白的晶体结构以后,对抗冻蛋白如何吸附到冰晶体上提出了具体假设,认为由于这种蛋白的双亲螺旋结构形成了双电极现象。由此诱导冰晶的水分子形成双极结构。沿螺旋面通常具有极性氨基酸(如Thr、Ash、Asp)的空间排列,极性残基(特别是Thr)键合于冰晶上,使抗冻蛋白吸附于冰晶上,在抗冻蛋白的另一面呈现相对液态水的疏水柱,从而抑制冰晶的生长。Wen等人采用蛋白类比和冰晶侵蚀的研究建立了抗冻蛋白和冰晶作用的模型。通过这一模型模拟了由Winter flounder中提取的抗冻蛋白与冰晶作用的情况,结果说明,该蛋白确实以特殊形式在Thr、Asn和Asp侧链上以氢键键合于冰晶的六棱体双锥平面上,从而抑制冰晶的生长。此模型进一步假设键合是非定向地以尽量大的机会将抗冻蛋白的分子堆于冰面上,冰晶生长的抑制是通过两个作用过程进行的,即氢的键合作用过程和疏水的蛋白内部分子的相互作用过程,这较好地解释了抗冻蛋白溶液在低浓度时冰晶沿六棱体双锥面缓慢生长,当达到临界浓度时,由于抗冻蛋白分子堆在一起,内部分子间相互作用,大大增加了键合和活性,冰晶停止生长,只有达到其冰点时,冰晶沿c轴方向快速生长,形成针状冰晶,抑制它在其他方向的扩展。Chou利用Monte Carlo模拟和能量极小化冬鳕抗冻蛋白结构和抗冻机理,提出冬鳕抗冻蛋白是通过四个Thr侧链氢键与冰晶中沿着(OIT2)方向的氧原子产生相互作用,从而抑制冰晶的生长。Knignt等通过实验提出抗冻蛋白AFGP7、AFGPs通过双糖与冰晶形成氢键吸附到冰晶表面,从而抑制冰晶的生长。

1.3 抑制冰的重结晶 所谓重结晶是指在已经形成的冰晶体颗粒大小的重新分布,即一些冰晶增大,而另一些减小,并且大的冰晶愈长愈大,小的越来越小,直至消失。这种情形主要是由温度波动引起,对动植物组织尤其是植物组织因冰晶体的增大而产生严重的机械损伤。而AFPs具有抑制重结晶发生的作用,所形成的晶粒体积小而且比较均匀。自1992年加拿大Griffith第一次从冬黑麦中获得植物AFPs以来,已先后从冻大麦、小麦燕麦、沙冬青和胡萝卜等质外体中获得AFPs。这些AFPs在体外水溶液中均表现出典型的热滞响应和重结晶抑制活性。在耐冻植物内和耐冰昆虫(仅限于细胞外结冰)体内,重结晶抑制作用可能比热滞效应更为重要。在植物体内AFPs的热滞值通常为0.2℃-0.6℃,靠此来降低冰点,避免结晶的作用是很小的。AFPs主要通过重结晶抑制作用来避免冰晶体对细胞组织的伤害,因为重结晶化的抑制作用比冰晶生长的抑制作用更容易达到,只需少量AFPs(20μg/ml),就有较高的重结晶化抑制活性。

1.4 调节动植物原生质体的过冷状态,使过冷点降低 许多寒冷地区昆虫和植物能在-25℃以下的环境下生存,免于冰冻伤害,仅依靠AFPs的热滞效应来降低冰点是不能解释的。事实上,它们抗冻性的提高是依靠原生质体的过冷作用,这可能暗示着AFPs在生物体内的抗冻作用不仅是降低冰点,更重要的作用是调节原生质溶液的过冷状态,使过冷点降低。这一推断基于以下实验结果:①AFPs的合成和过冷点的降低具有时间上的一致性,AFPs的变化和鱼类、昆虫的过冷点变化一致性似乎表明这个推论是成立的,例如昆虫Weracantha contracta的体液,在二月份当地气温最低时,体液过冷点最低,AFPs积累量也最大;随着气温回升,过冷点也增高,AFPs积累减少。②AFPs活性和冰核蛋白(促进冰晶生长的蛋白)的活性变化呈相反的趋势。Olsen和Duman比较冬季和夏季D.canadensis血淋巴冰核蛋白和AFPs的活性变化发现,冬季冰核蛋白的活性降低,夏季升高,而AFPs活性则正好相反。③AFPs能降低冰核蛋白的活性。冬季D.canadensis血淋巴具有抗冻活性,这种血淋巴能抑制自身的脂蛋白冰核剂活性。同时从这种血淋巴中能纯化出的AFPs也能抑制体内的冰核蛋白活性。由此可以推测,AFPs在昆虫体内的一个重要作用在于通过调整体液或原生质的状态,如与多元醇类等依数性抗冻剂协同作用、抑制冰核蛋白活性作用等,使溶液达到一种过冷态、从而降低过冷点。推测植物AFPs可能也有类似的功能,否则越冬植物就不可能在远低于冰点的低温环境中生存。这是基于一些相关的实验结果的推断,并没有直接的实验证据。 此外,AFPs还可以抑制玻璃化损伤,这也许通过阻断Ca2+和K+离子通道达到对细胞膜的保护作用。

2 抗冻蛋白的结构与功能

2.1 鱼类的抗冻蛋白 目前已了解的鱼抗冻蛋白大致可分为四类:抗冻糖蛋白(AFGPs),工型抗冻蛋白(AFPl),Ⅱ型抗冻蛋白(AFPⅡ),及Ⅲ型抗冻蛋白(AFPⅢ)它们在分子结构上各异,其中研究得较详细的是I型抗冻蛋白。

2.1.1 AFGPs 主要存在于生活在两极的某些鱼类中,如齿鱼类(Dissostichus)、贝氏肩鲞(Trematomus bernacchii)及北半球高纬度海域中的鱼如大西洋鳕(Gadus morhua)、北鳕(Boreogadus Saida)的血液中。最初是在Antarctic nototheniid中发现,AFGPs是一种含双糖的三肽聚合体,多肽是由(Ala-Ala-Thr)。三肽重复单位组成,n为4~50;双糖为β-D-半乳糖与2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D半乳糖通过β1-3键连接,双糖以。糖苷键连接于苏氨酸残基的羟基上,在C端接1~2个Ala,根据重复数n的多少形成一系列分子质量在2.5~37.7KDa的抗冻蛋白。糖基是决定抗冻性的主要基团,因为化学修饰(乙酰化和过氧化)糖基后会导致抗冻活性的消失。二糖结构中顺式构象的相邻羟基对THA至关重要。当二糖为半乳糖时,C3、C4位上的羟基为活性基团。实验表明,这类抗冻糖蛋白的活性与分子量有关,分子量大者,一般活性也高。Davis等推测,AFGPs在溶液中以左手-折叠螺旋存在,所有的双糖基团处于分子同一侧,而相对疏水的丙氨酸基团处于另一侧。经NMR分析表明,双糖的亲水基团与水分子形成氢键,阻止冰晶的生成。

2.1.2 AFP工 在美州黄盖鲽鱼(Pseudop1e-uronectus arnericanus)、床杜父鱼(Myaxocephalus scorpius)等中存在。分子量3.3-4.5KDa,富含丙氨酸,但无糖基。目前对Winterfiouder的抗冻蛋白研究最为深入,其一级结构是由11个氨基酸残基组成的多肽单元,(Thr-(Alx)2-Asx-(Alx),-)重复串联而成,这其中Alx主要为丙氨酸,占总氨基酸的60%以上。间或有些利于α螺旋形成的非极性氨基酸如Leu,lys等,而Asx则为Asp或Asn。通过X射线研究其晶体结构,发现其一级结构具有单一的α-螺旋结构,这种蛋白的一级结构决定其二级结构则形成相应的双亲螺旋结构(amphiphilic),即亲水性氨基酸侧链位于螺旋轴的一侧,疏水性氨基酸侧链位于另一侧。从而形成这种双亲现象。其亲水性氨基酸具有较大的摆动性,这样可以粘附到不同的冰晶体表面,促进与冰晶体结合,从而抑制冰晶生长,该结构有较好的热稳定性,Asn/Asp的比例和苏氨酸是影响其抗冻活性的主要因子。

2.1.3 AFPⅡ 存在于美绒杜父鱼(Hemitrip-terusarnericanus),彩虹胡瓜鱼(Osmerusmordax),大西洋鲱(Clupeaherengus),分子量14~16 KDa,是目前唯一的在蛋白质序列中查出与其他蛋白具有同源性的一类蛋白,与动物C型凝集素同源,AFPⅡ的特点是不含糖类,富含半胱氨酸,其中50%的Cys能形成二硫键,这些二硫键对保持分子结构稳定性及抗冻活性有重要的作用。巯基乙醇或二硫苏糖醇处理会导致THA丧失。它们最初是在Sea raven鱼中发现的,对其脱氧核糖核酸(cDNA)序列分析及根据cDNA转译氨基酸顺序的分析表明该种成熟的抗冻蛋白可能来自一个大约163个氨基酸长的前体蛋白有129个氨基酸长的多肽,其二级结构是由一个少量α-螺旋和β-折叠以及大量转角结构组成,并有一个折叠的三级结构,1991年又在昆虫Tenebrio molitor和Dendroidea canadensis中发现这类蛋白。

2.1.4 AFPⅢ 主要存在于绵亚科鱼类。首先在鱼Ocean pout中发现AFPⅢ,其中8个AFPs从大洋条鳕中分离出来,和AFPⅡ一样,AFPⅢ是一种球状结构的蛋白分子,但它们既不富含Ala,又不富含Cys,分子质量约6KDa,用NMR和X-射线衍射技术分析表明,其二级结构主要由9个β-折叠组成,其中8个组成一种β-折叠三明治夹心结构,另一个β-折叠则游离在其外,这种三明治的"夹心"就是两个反向平行的3个串联β-折叠,其外边是两个反向平行的β-折叠。β股之间有亲水域(4~8A)可与冰表面结合。

2.1.5 AFPⅣ 是最近Deng等1987年从多棘麻杜父鱼(Myoxocephalus octodecimipinosis)的皮肤中纯化出的一种新型AFPs,大约108个氨基酸残基。在其N端连接有一个焦谷氨酸酰基团,并且含有高达17%的Glu。该蛋白和膜载脂酰蛋白具有22%的同源性。圆二色谱分析表明该蛋白和载脂酰蛋白结构类似,有较高的α-螺旋结构,其中4个α-螺旋束反向平行排列,疏水基团向内,亲水基团向外,这些亲水基团可能和冰晶表面结合。推测这种蛋白阻止冰晶体从皮肤表面渗入。

2.2 昆虫的抗冻蛋白 昆虫抗冻蛋白(AFPs)的分子量一般为8~20KD,无糖基,与鱼类I型AFPs相似,含有较多的亲水性氨基酸(例如Thr,Ser,Asx,Glx,Lys,Arg),有40%~59%的氨基酸残基能形成氢键。有些昆虫AFPs类似于鱼类Ⅱ型AFPs,含有一定数量的半胱氨酸。和鱼类、植物AFPs相比,昆虫AFPs具有更高的抗冻活性和独特的化学结构特征,Graham等从黄粉甲(Tenebriomolitor)的血淋巴中分离出一种AFP,其热滞活性是鱼类的100多倍,富含Thr和Set,分子量约8.4KD,一级结构由12个氨基酸的重复序列组成。Duman等从D.danadesis中分离出2种AFPs,DAFPl和DAFP2,分子量约8.7 KD,分别含83处84个氨基酸残基。它们组成7个含12或13个氨基酸残基的重复单元。每6个残基中有一个半胱氨酸,因此富含二硫键,这些二硫键使DAFPI和DAFPⅡ结构稳定,能耐受100℃的高温。用DTT处理,减低这些二硫键,或使游离羟基烷基化,AFPs随之失去活性。云杉卷叶蛾(Choristoneura famiferana)与鱼类(如美州绒杜文鱼Hemitripterus americanue)Ⅱ型AFPs有免疫交叉反应,说明这些鱼类和昆虫的AFPs有共同的抗原决定簇。

2.3 植物抗冻蛋白 植物抗冻蛋白研究起步较晚。绝大多数已研究的植物材料中,抗冻蛋白活性(热滞值通常为0.2~-0.5℃)大大低于鱼类(0.51~1.5℃)和昆虫(3~6℃。1992年加拿大的Griffith等首先从冬黑麦非质体中分离到7个AFPs,具有相似的氨基酸组成。Hon等LNj证明这7个AFPs中有3个AFPs的N-端序列与3种抗真菌蛋白(内切几丁质酶、β-1、3葡聚糖酶及甜蛋白类似蛋白)具有同源性,经免疫检测表明,它们分别是几丁质酶,β-1,3葡聚糖酶和甜味蛋白类似蛋白。这说明冬黑麦中抗冻和抗病反应可能有着共同的或相似的反应体系。从强抗冻植物沙冬青(Ammopitanthus mongolicus)叶片中分离出热稳定的AFPs,其中一种抗冻糖蛋白,测定其N端20个氨基酸的序列,表明它和植物凝集素有同源性。从这些研究结果来看,AFPs可能具有多重功能,既具有抗冻活性同时又有酶(如几丁质酶、13-1,3葡聚糖酶)、或抗菌(如甜味蛋白)、抗虫活性(植物或动物凝集素)。

3 抗冻蛋白在果蔬保鲜中的应用前景 抗冻蛋白的特性在20世纪60年代末报道后,美、加、英等国很多学者纷纷寻找它的应用,但抗冻蛋白只能很小限度的降低冰点,与常用的可食用的抗冻剂相比,效果不显著,且自然生产量很小,因此充分运用到食品中去条件不成熟。基因工程的发展为抗冻蛋白的应用提供了良好的条件,即运用基因过程的方法把异源的高活性的AFP的基因转移到目标果蔬上,使之表达。这种遗传特性的改良,从根本上增强果蔬在田间的抗寒能力,而且会改善果蔬采后的贮藏加工特性。新鲜果蔬贮藏时均需有适宜的最低温度,低于此温度常造成果蔬的冰害和冻害。适宜低温点的选择往往取决于贮藏对象的耐低温能力。贮藏温度若能降低1℃,就可以明显延长某些果蔬的贮藏寿命。 速冻果蔬在冻藏解冻过程中常出现的主要问题是汁液流失(drip loss)、软烂、失去原有的形态。造成汁液流失的原因与食品的原料处理、冻结方式、包装、冻藏条件以及解冻方式有关,最关键的因素是冻藏过程中的温度波动导致重结晶。能表达AFPs的转基因蔬菜可改善这种状况,提高速冻品的质量。这是因为转基因蔬菜在冻结与冻藏中冰晶对细胞和蛋白质的破坏很小,合理解冻后,部分融化的冰晶也会缓慢渗透到细胞内,在蛋白质颗粒周围重新形成水化层,使汁液流失减少,保持了解冻食品的营养成分和原有风味。 人们将鱼的AFP I抗冻蛋白渗入到植物叶和茎的组织中使其冰点降低了1.8℃以上,在植物悬浮培养细胞低温保存时,抗冻蛋白可起到冰冻保护剂一样的作用,而抗冻蛋白也能降低植物细胞内冰晶形成速度,这表明鱼抗冻蛋白在植物中具有抗冻活性。AFP广泛应用的主要问题为其来源和成本,许多科学家尝试用低廉的细菌来定向生产AFP,蒋耀青等将黄盖鲽AFP基因(CDNA)转入大肠杆菌,用ELISA方法检测了其表达活性。Sun等从生长在加拿大北极地区的植物的根际分离到一种根瘤(Pesudomonasputida GRl2-2)。该细菌能在冬春季5℃低温条件下增殖并能促进菜油(Brassicanapus)根系的伸长。不仅如此,该菌还能度过-20℃和-50℃的冰冻温度而存活下来。在研究其抗冻机制的过程中发现,该菌在其后的5℃生长温度下,会合成和分泌一种具有抗冻活性的蛋白质,通过对细菌生长介质的分离、提纯和鉴定,获得一种分子量在32000~34000KDa之间的主要蛋白质和许多小蛋白组分,但未弄清楚究竟是哪一种蛋白质分子具有抗冻活性。Sun的工作给人一种希望,因为用细菌来生产细菌本身的抗冻蛋白不存在表达障碍问题。 基因工程技术的发展,为利用因过程技术将抗冻蛋白基因导入植物中以得到高水平的表达,由此获得抗冻的植物品种有着诱人的前景。1998年10月英国York大学的Dawn等诱导纯化了胡萝卜AFPs并得到了其基因,标志着第一个植物AFPs基因的发现。这种在胡萝卜的直根中诱导表达,分子质量为36ku的抗冻蛋白,是一种糖蛋白,体外热滞值0.35℃,去掉糖侧链并未影响其抑制重结晶的活性。其cDNA全长1140 bp,DNA全长1238 bp,编码332个氨基酸。cDNA转到烟草中表达,结果在正常温室环境生长的烟草中抗冻蛋白得到积累。在此之前,只有鱼类4种AFP的基因结构研究得较为清楚,昆虫和植物一无所知。因此人们从事AFP基因工程的目的基因只有来源于鱼类。 Georges等根据美洲黄盖鲽鱼的I型抗冻蛋白的基因序列,合成了一个包括21氨基酸信号肽及37氨基酸成熟抗冻蛋白的基因,转入到玉米的原生质体中,并已表达。Mueller等合成了编码由2个至6个重复11氨基酸序列的一系列工型抗冻蛋白基因转入番茄中表现出重结晶的抑制活力。美国DNA工程公司在番茄中导入抗冻蛋白基因,降低了细胞内水分的凝固,培育出的耐寒番茄,在-6℃能生存几个小时,果实冷藏后不变形。 目前,植物抗寒基因工程取得了一定进展,但是这方面的研究仅刚开始,还有许多需要深入的研究探讨。例如在昆虫体内存在的热滞蛋白可降低冰点大6℃,而鱼的抗冻蛋白一般降低冰点2℃左右,但昆虫抗冻基因的克隆极其植物基因工程的工作尚未开展。随着植物抗寒基因工程研究的不断深入。生物合成AFPs的成本会大大下降,使AFPs用于果蔬商业化保鲜成为可能。同时,更多的耐寒果蔬将被获得。到那时,人们将在市场上买到品种繁多,品质优良的新鲜果蔬。当然,要实现这一美好的愿望,还有许多问题要解决,这包括技术上、安全上和经济上等一系列问题。

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